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溫和氣單胞菌PCR檢測試劑盒使用方�

2022�11�11�
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� � �上海谷研�(shí)�(yè)有限公司 需要積�0
�(guān) � �溫和氣單胞菌PCR檢測試劑�, 溫和氣單胞菌PCR檢測試劑�, 溫和氣單胞菌PCR檢測試劑�
【資料簡介�

                       溫和氣單胞菌PCR檢測試劑盒說明書

特點(diǎn)�(yōu)勢:

 

    1.   特異性:所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過詳盡的生物信息�(xué)分析,經(jīng)過GenBank及自建龐大數(shù)�(jù)庫的比對,確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段,可實(shí)�(xiàn)對細(xì)菌種屬及血清型的特異檢測,特異性均�(dá)�100%�

 

    2.   重現(xiàn)性:該系列所有產(chǎn)品均�(jīng)過大量實(shí)�(yàn)菌株的驗(yàn)證,重現(xiàn)性為100%�

 

    3.   靈敏性:該系列產(chǎn)品可�(shí)�(xiàn)對檢測菌的高靈敏檢測,當(dāng)樣品中細(xì)菌的濃度�(dá)�103cfu/ml�(shí),可�(shí)�(xiàn)對其的直接檢測,無需繁瑣的增菌過程�

 

    4.   �(shí)用性:檢測范圍廣,涵蓋了對人體危害較為�(yán)重的17種呼吸道及腸道致病菌,可�(shí)�(xiàn)對臨床樣品及其他�(huán)境取樣的快速檢測,整�(gè)檢測過程�3-4�(gè)小時(shí)�

 

    5.   �(yōu)�1:序列資源豐富,除GenBank公布的序列外,公司還�(jìn)行了大量菌株的序列破譯,從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性�

 

    6.   �(yōu)�2:該系列試劑盒均�(jīng)過大量的保守性及特異性實(shí)�(yàn)�(yàn)證,憑借公司擁有的豐富的菌種資源,每一種檢測試劑盒均經(jīng)過了20余種�(biāo)�(zhǔn)菌株和臨床菌株的保守性驗(yàn)證及40余種近緣�(biāo)�(zhǔn)菌株和臨床菌株的特異性驗(yàn)證,確保在使用過程中不會出現(xiàn)任何的假陽性及假陰性報(bào)告結(jié)果�

PCR使用方法�

 

一、樣� DNA 的制�

 

1. 用自選方法純化樣品的 DNA,本�(chǎn)品跟市場上絕大多�(shù)核酸純化�(chǎn)品兼容�

 

2. 如果� N �(gè)樣品,則需要�(jìn)� N+2 �(gè)樣品提取,多出的一�(gè)用作樣品制備陽性對照管、另一�(gè)用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶� DNA 釋放劑試用裝。則按下面步驟操作: 

 

3. 配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液(足夠 10 �(gè)樣品)為例:在一干凈塑料

 

管中加入 10uL 溶液 A 成分一�20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超純水,充分混合均勻即可。溶� A 工作液可室溫放置,但最好在一周內(nèi)用完,不要長期放置。一次檢測一�(gè)樣品需� 100uL 溶液 A 工作液,1mL 工作液足� 10 �(gè)樣品。如果待測樣品數(shù)量為其他�(shù)字,

配制的溶� A 工作液的體積需要做相應(yīng)的調(diào)整�

 

4. 在標(biāo)記好� N+2 �(gè)離心管中,加� 1-5mg 固體樣品(半粒芝麻大小,如奶酪)�5uL 液體樣品(如牛奶)待測樣品。在樣品制備陽性對照中加入 5uL 陽性對照,在樣品制備陰性對照中加入 5uL 水�

 

5. 在每�(gè)管中加入 100 uL 溶液 A 工作液,確保固體樣品被溶液淹埋,如果是液體樣品則震蕩混勻�

 

6. 95℃保� 10 分鐘�

 

7. 待冷卻到常溫后加� 10uL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液。每�(gè)樣品得到� DNA釋放液足夠�(jìn)� 50-100 � PCR�

�(shí)�(yàn)�(guī)則:

 

1、要保證移液槍的�(zhǔn)確性,誤差不能超過2%。可用水和電子天平�(jìn)行確定。但有專�(yè)人員�(jìn)行矯正�

2、要配備20ul�50ul�100ul�1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后,要更換槍頭。即使是吸取�(biāo)�(zhǔn)品時(shí)�

3、要在實(shí)�(yàn)�1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出,使各種試劑都恢�(fù)到室溫,以使�(jié)果更�(wěn)定�

4、實(shí)�(yàn)�(shí),要使底物避光保存�

5、用槍吸取液體時(shí)速度不能太快,以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不�(zhǔn)確�

6、吸取液體時(shí),要用量程和需要量接近的槍去吸,減少誤差�

7、將液體加到酶標(biāo)孔中�(shí),避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸,可使槍頭上的液滴和孔壁接觸,液滴會自然流下去�

8、液體全部加完后,可將酶�(biāo)板在桌子上平行輕輕晃�30秒,混勻液體。也可以用酶�(biāo)儀的晃動功能�

9、應(yīng)盡量做雙孔實(shí)�(yàn),這樣才能保證�(shù)�(jù)的準(zhǔn)確性�

10、對�(jié)果有疑問的樣品要用其它方法�(jìn)行確證�

PCR反應(yīng)流程常規(guī)程序

 

將PCR反應(yīng)所需的成分配置完后,在PCR儀上于94-96℃預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘,使模板DNA充分變性,然后�(jìn)入擴(kuò)增循�(huán)。在每一�(gè)循環(huán)中,先于94℃保�30秒鐘使模板變性,然后將溫度降到復(fù)性溫度(一�50-60℃之間),一般保�30秒鐘,使引物與模板充分退火;�72℃保�1分鐘(擴(kuò)�1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一�(gè)循環(huán)。重�(fù)這樣的循�(huán)25�35次,使擴(kuò)增的DNA片段大量累積。最后,�72℃保�3-7min,使�(chǎn)物延伸完整,4℃保存�

 

2.復(fù)性(退火)和延伸溫�

 

�(fù)性的溫度是PCR�(kuò)增是否順利的�(guān)鍵因素,通常�50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多�(shù)�(shè)定為72℃。如果復(fù)性的溫度很高,可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度,變成二步法PCR�

 

3.反�(yīng)�(shí)�

 

變性步驟一般使�30秒鐘,如果模板的G+C含量較高,或直接用細(xì)胞做模板,變性時(shí)間可適當(dāng)延長。復(fù)性時(shí)間有30秒種一般是足夠的。延伸時(shí)間由�(kuò)增產(chǎn)物的大小決定,一般采�1kb�1分鐘來保證充足的�(shí)間�

 

4.循�(huán)次數(shù)

 

循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始�(shù)量有�(guān),在模板拷貝�(shù)�104�105�(shù)量級�(shí),循�(huán)�(shù)通常�25�35次�

 

平臺效應(yīng)(plateaueffect):PCR�(kuò)增過程后期會出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。原因:底物和引物的濃度已經(jīng)降低,dNTP和DNA聚合酶的�(wěn)定性或活性降低,�(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端�(chǎn)物抑制作用,非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用,�(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性,高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不ce底�

 

5.PCR反應(yīng)液的配制

 

PCR反應(yīng)體系的配置方式有�(shí)也會影響反應(yīng)的正常�(jìn)行。常�(guī)方法與其它酶�(xué)反應(yīng)一樣,在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子,要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油,防止水分蒸�(fā)�

 

對于使用�3�-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時(shí),有�(shí)會擴(kuò)增不出產(chǎn)物。在遇到這�(gè)問題�(shí),如果將反應(yīng)成分分開配制,A管含模板、引物和dNTP,以及調(diào)整體積的H2O,B管含緩沖液、DNA聚合酶和水,然后再將兩管溶液混合起來,可較好地克服這�(gè)問題�

 

按照常規(guī)的方法配制反�(yīng)體系,有�(shí)會出�(xiàn)非特異性擴(kuò)增的問題。熱啟動(hotstart)PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液,Mg2+和primer先配制好,然后加入一粒蠟珠(如AmpliWaxPCRQam100),加熱熔化,再冷卻,使蠟將溶液封住,最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當(dāng)PCR反應(yīng)�(jìn)入高溫階段后,蠟層熔化,所有反�(yīng)成分才會混合在一起�

�(shí)�(yàn)注意事項(xiàng)�

 

1)RT-PCR可以檢測組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等很多材料,不同的樣本有不同要求,�(shí)�(yàn)前請充分溝通確�(rèn)�(shí)�(yàn)方案和樣本情況;

 

2)客戶盡可能提供�(shí)�(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號;

 

3)客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品�

 

4)樣本保存于液氮或干冰,也可以保存于Trizol液中�

 

�(shí)�(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基�(tuán),利用熒光信號積累實(shí)�(shí)�(jiān)測整�(gè)PCR�(jìn)程,*通過�(biāo)�(zhǔn)曲線對未知模板�(jìn)行定量分析的方法。實(shí)�(shí)熒光定量PCR的化�(xué)原理包括探針類和非探針類兩類,探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加,非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)�(jì)的引物來指示�(kuò)增的增加。運(yùn)用該技�(shù)可以對DNA、RNA樣品�(jìn)行定量(包括*定量和相對定量)和定性分析�

 

主要服務(wù):DNA或RNA�*定量分析、基因表�(dá)差異分析、基因分型�

 

主要技�(shù):引物設(shè)�(jì)、RNA提取、cDNA合成、qPCR�

 

試劑使用須知�

�1)請參照相關(guān)法規(guī)、文�(xiàn)、MSDS等信息,理解并掌握好試劑的特性,再�(jìn)行安全操作。產(chǎn)品僅用于科研

�2)通常購買試劑�(shí)一定要想到一次性用完。若估算不足有剩余的話,更加注意其他保管和管理�

�3)萬一試劑操作者并非專�(yè)技�(shù)人員。必須在專業(yè)人士的指�(dǎo)�(jiān)督下�(jìn)行操作。對于使用后的廢棄物,不要或者舊的試劑,�(yīng)按照相關(guān)法律法規(guī)正當(dāng)處理�

�4)購買后,請�(wù)必確�(rèn)�(biāo)簽上的注意事�(xiàng);做好預(yù)防顛倒,摔壞的措施和管理體制;在使用前再次確�(rèn)�(biāo)簽上的注意事�(xiàng),做好必要的安全對策;對沒有�(biāo)明其危害特性、有害特性的,也要慎重地�(jìn)行操作;必須帶好防護(hù)用具,小心翼翼�(jìn)行操作�



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