榛戣壊鏅浄娌冭弻PCR妾㈡脯瑭﹀姂鐩掑椹楀師鐞�
2022骞�11鏈�11鏃�| 璩囨枡椤炲瀷 | docx鏂囦欢 | 璩囨枡澶у皬 | 15154 |
| 涓嬭級娆℃暩 | 4 | 璩囨枡鍦栫墖 | 銆愰粸鎿婃煡鐪嬨�� |
| 涓� 鍌� 浜� | 涓婃捣鐮旂敓鐢熷寲瑭﹀姂鏈夐檺鍏徃 | 闇�瑕佺⿳鍒� | 0 |
| 闂� 閸� 瑭� | 榛戣壊鏅浄娌冭弻PCR妾㈡脯瑭﹀姂鐩�,榛戣壊鏅浄娌冭弻PCR妾㈡脯瑭﹀姂鐩�,榛戣壊鏅浄娌冭弻PCR妾㈡脯瑭﹀姂鐩� | ||
- 銆愯硣鏂欑啊浠嬨��
榛戣壊鏅浄娌冭弻PCR妾㈡脯瑭﹀姂鐩掕鏄庢浉
鐢㈠搧鐗瑰緛:
闈堟晱搴﹂珮锛氳兘灏嶄綆鎷疯矟鎴栧妯ｆ�фā鏉块�茶瀹氶噺銆�
鐗圭暟鎬у挤锛氶噰鐢ㄧ啽鍟熷嫊閰剁殑婵�娲绘鍒讹紝鎶戝埗闈炵壒鐣版�ф摯澧� 銆�
閲嶅京鎬уソ锛氭摯澧炴洸绶氶噸鍚堝害楂�锛屽彈骞叉摼褰遍熆灏�銆�
鎿村鏁堢巼楂橈細鎿村鏇茬窔Ct鍊间綆锛岃捣宄板揩锛屾晥鐜囬珮銆�
鍘熺悊:
鎵�璎傚鏅傜啋鍏夊畾閲廝CR鎶�琛擄紝鏄寚鍦≒CR鍙嶆噳楂旂郴涓姞鍏ョ啋鍏夊熀鍦�锛屽埄鐢ㄧ啋鍏変俊铏熺⿳绱鏅傜洠娓暣鍊婸CR閫茬▼锛屽悗閫氶亷妯欐簴鏇茬窔灏嶆湭鐭ユā鏉块�茶瀹氶噺鍒嗘瀽鐨勬柟娉曘��
闇�瑕佽嚜鍌欑殑鍣ㄦ潗锛�
1锛庡剙鍣細鍒嗘瀽澶╁钩銆侀洟蹇冩銆佺啋鍏� PCR 鎿村鍎�銆佺祫绻旂爺纾ㄥ櫒銆�-20 鈩冨啺绠�銆佸彲瑾跨Щ娑插櫒锛�2 µL銆�20µL銆�200 µL銆�1000 µL锛�銆�
2锛庤�楁潗锛氱啋鍏� PCR 鍙嶆噳绠�銆佺溂绉戝壀銆佺溂绉戦懛銆佺敓鐞嗛菇姘�銆�1.5 mL 缍撶劍纰抽吀浜屼箼閰紙DEPC锛夋按
铏曠悊鐨勬粎鑿岄洟蹇冪銆佸惛闋紙10 µL銆�200 µL銆�1000 µL锛�銆佹粎鑿岄洐钂告按銆�
鍏锋湁涓嬪垪鐗归粸锛�
1.鐢㈠搧鍍呯敤浜庣鐮斿嵆闁嬪嵆鐢紝鐢ㄦ埗鍙渶瑕佹彁渚涙ǎ鍝� DNA 妯℃澘锛屾搷浣滅啊鍠�锛屽畾閲忔簴纰哄揩閫熴��
2. 寮曠墿缍撻亷鍎寲锛岀壒鐣版�у挤銆傞爯鏈熺殑 PCR 鐢㈢墿闀峰害鐐� 560 bp銆�
3. PCR mix 涓惈涓婃ǎ鏌撴枡锛孭CR 鍚庡彲浠ョ洿鎺ヤ笂妯ｉ浕娉�銆�
4. 鎻愪緵闄芥�у皪鐓�锛屼究浜庡垎鏋愯│椹楃祼鏋�銆�
妾㈡脯鏂规硶锛�
1.鈪犳硶锛�
鍦≒CR鍙嶆噳楂旂郴涓紝鍔犲叆閬庨噺SYBR鐔掑厜鏌撴枡锛孲YBR鐔掑厜鏌撴枡鐗圭暟鎬у湴鎽诲叆DNA闆欓張鍚庯紝鐧煎皠鐔掑厜淇¤櫉锛岃�屼笉鎽诲叆閺堜腑鐨凷YBR鏌撴枡鍒嗗瓙涓嶆渻鐧煎皠浠讳綍鐔掑厜淇¤櫉锛屽緸鑰屼繚璀夌啋鍏変俊铏熺殑澧炲姞鑸嘝CR鐢㈢墿鐨勫鍔爓an鍏�鍚屾銆�
瀹氶噺PCR鎿村鐔掑厜鏇茬窔鍦�
PCR鐢㈢墿鐔旇В鏇茬窔鍦�
2.TaqMan鎺㈤嚌娉曪細
鎺㈤嚌瀹屾暣鏅�锛屽牨鍛婂熀鍦樼櫦灏勭殑鐔掑厜淇¤櫉琚番婊呭熀鍦樺惛鏀讹紱PCR鎿村鏅傦紝Taq閰剁殑5鈥�-3鈥欏鍒囬叾娲绘�у皣鎺㈤嚌閰跺垏闄嶈В锛岀敘鍝佸儏鐢ㄤ簬绉戠爺浣垮牨鍛婄啋鍏夊熀鍦樺拰娣粎鐔掑厜鍩哄湗鍒嗛洟锛屽緸鑰岀啋鍏夌洠娓郴绲卞彲鎺ユ敹鍒扮啋鍏変俊铏�锛屽嵆姣忔摯澧炰竴姊滵NA閺�锛屽氨鏈変竴鍊嬬啋鍏夊垎瀛愬舰鎴�锛屽鐝句簡鐔掑厜淇¤櫉鐨勭疮绌嶈垏PCR鐢㈢墿鐨勫舰鎴恮an鍏�鍚屾銆�
鐔掑厜瀹氶噺PCR瀵﹂姝ラ锛�
鈶犲彇鍑嶅瓨宸茶瑙ｇ殑绱拌優锛屽婧斁缃�5鍒嗛悩浣垮叾wan鍏ㄦ憾瑙�銆�
鈶″叐鐩稿垎闆� 姣�1ml鐨凾RIZOL瑭﹀姂瑁傝В鐨勬ǎ鍝佷腑鍔犲叆0.2ml鐨刲vfang锛岃搵绶婄钃�銆傛墜鍕曞妵鐑堟尟钑╃楂�15绉掑悗锛�15鍒�30鈩冨鑲�2鍒�3鍒嗛悩銆�4鈩冧笅12000rpm闆㈠績15鍒嗛悩銆傞洟蹇冨悗娣峰悎娑查珨灏囧垎鐐轰笅灞ょ殑绱呰壊閰歭vfang鐩�锛屼腑闁撳堡浠ュ強鐒¤壊姘寸浉涓婂堡銆俁NA鍏ㄩ儴琚垎閰嶄簬姘寸浉涓�銆傛按鐩镐笂灞ょ殑楂旂⿳澶х磩鏄嫽婕挎檪鍔犲叆鐨凾RIZOL瑭﹀姂鐨�60%銆�
鈶NA娌夋穩 灏囨按鐩镐笂灞よ綁绉诲埌涓�骞插噲鐒NA閰剁殑闆㈠績绠′腑銆傚姞绛夐珨绌嶇暟涓欓唶娣峰悎浠ユ矇娣�鍏朵腑鐨凴NA锛屾贩鍕诲悗15鍒�30鈩冨鑲�10鍒嗛悩鍚�锛屼簬4鈩冧笅12000rpm 闆㈠績10鍒嗛悩銆傛鏅傞洟蹇冨墠涓嶅彲瑕嬬殑RNA娌夋穩灏囧湪绠″簳閮ㄥ拰鍋村涓婂舰鎴愯啝鐙�娌夋穩濉�銆�
鈶NA娓呮礂 绉诲幓涓婃竻娑诧紝姣�1mlTRIZOL瑭﹀姂瑁傝В鐨勬ǎ鍝佷腑鍔犲叆鑷冲皯1ml鐨�75%涔欓唶(75%涔欓唶鐢―EPCH2O閰嶅埗)锛屾竻娲桼NA娌夋穩銆傛贩鍕诲悗锛�4鈩冧笅7000rpm闆㈠績5鍒嗛悩銆�
鈶NA骞茬嚗 灏忓績鍚稿幓澶ч儴鍒嗕箼閱囨憾娑�锛屼娇RNA娌夋穩鍦ㄥ婧┖姘ｄ腑骞茬嚗5-10鍒嗛悩銆�
鈶ユ憾瑙NA娌夋穩 婧惰ВRNA鏅傦紝鍏堝姞鍏ョ劇RNA閰剁殑姘�40渭l鐢ㄦ鍙嶅京鍚规墦骞炬锛屼娇鍏秝an鍏ㄦ憾瑙�锛岀嵅寰楃殑RNA婧舵恫淇濆瓨浜�-80鈩冨緟鐢ㄣ�� 1)绱鍚告敹娉曟脯瀹氬厛鐢ㄧ█閲嬬敤鐨凾E婧舵恫灏囧垎鍏夊厜搴﹁▓瑾块浂銆傜劧鍚庡彇灏戦噺RNA婧舵恫鐢═E绋�閲�(1:100)鍚�锛岃畝鍙栧叾鍦ㄥ垎鍏夊厜搴﹁▓260nm鍜�280nm铏曠殑鍚告敹鍊�锛屾脯瀹歊NA婧舵恫 婵冨害鍜岀磾搴�銆傚弽鎳変簲瑕佺礌锛�
鏂皬鍒嗘灊妗胯弻PCR妾㈡脯瑭﹀姂鐩掕不鐢ㄥ弮鍔燩CR鍙嶆噳鐨勭墿璩富瑕佹湁浜旂ó鍗冲紩鐗┿�侀叾銆乨NTP銆佹ā鏉垮拰Mg2+
寮曠墿锛氬紩鐗╂槸PCR鐗圭暟鎬у弽鎳夌殑闂滈嵉锛孭CR 鐢㈢墿鐨勭壒鐣版�у彇姹轰簬寮曠墿鑸囨ā鏉緿NA浜掕鐨勭▼搴�銆傜悊璜栦笂锛屽彧瑕佺煡閬撲换浣曚竴娈垫ā鏉緿NA搴忓垪锛� 灏辫兘鎸夊叾瑷▓浜掕鐨勫鏍歌嫹閰搁張鍋氬紩鐗�锛屽埄鐢≒CR灏卞彲灏囨ā鏉緿NA鍦ㄩ珨澶栧ぇ閲忔摯澧�銆傝ō瑷堝紩鐗╂噳閬靛惊浠ヤ笅鍘熷墖锛�
鈶犲紩鐗╅暦搴︼細 15-30bp锛屽父鐢ㄧ偤20bp宸﹀彸銆�
鈶″紩鐗╂摯澧炶法搴︼細 浠�200-500bp鐐哄疁锛岀壒瀹氭浠朵笅鍙摯澧為暦鑷�10kb鐨勭墖娈�銆�
鈶㈠紩鐗╁牽鍩猴細G+C鍚噺浠�40-60%鐐哄疁锛孏+C澶皯鎿村鏁堟灉涓嶄匠锛孏+C閬庡鏄撳嚭鐝鹃潪鐗圭暟姊濆付銆侫TGC闅ㄦ鍒嗗竷锛岄伩鍏�5鍊嬩互涓婄殑鍢屽懁鎴栧槯鍟舵牳鑻烽吀鐨勬垚涓叉帓鍒椼��
鈶ｉ伩鍏嶅紩鐗╁収閮ㄥ嚭鐝句簩绱氱祼妲嬶紝閬垮厤鍏╂寮曠墿闁撲簰瑁滐紝鐗瑰垾鏄�3'绔殑浜掕锛屽惁鍓囨渻褰㈡垚寮曠墿浜岃仛楂�锛岀敘鐢熼潪鐗圭暟鐨勬摯澧炴甯躲��
鈶ゅ紩鐗�3'绔殑鍫垮熀锛岀壒鍒ユ槸鏈強鍊掓暩绗簩鍊嬪牽鍩�锛屾噳鍤存牸瑕佹眰閰嶅皪锛屼互閬垮厤鍥犳湯绔牽鍩轰笉閰嶅皪鑰屽皫鑷碢CR澶辨晽銆�
鈶ュ紩鐗╀腑鏈夋垨鑳藉姞涓婂悎閬╃殑閰跺垏浣嶉粸锛� 琚摯澧炵殑闈跺簭鍒楁湁閬╁疁鐨勯叾鍒囦綅榛�锛� 閫欏皪閰跺垏鍒嗘瀽鎴栧垎瀛愬厠闅嗗緢鏈夊ソ铏曘��
鈶﹀紩鐗╃殑鐗圭暟鎬э細寮曠墿鎳夎垏鏍搁吀搴忓垪鏁告摎搴殑鍏跺畠搴忓垪鐒℃槑椤悓婧愭��銆�
寮曠墿閲忥細姣忔寮曠墿鐨勬績搴�0.1锝�1umol鎴�10锝�100pmol锛屼互浣庡紩鐗╅噺鐢㈢敓鎵�闇�瑕佺殑绲愭灉鐐哄ソ锛屽紩鐗╂績搴﹀亸楂樻渻寮曡捣閷厤鍜岄潪鐗圭暟鎬ф摯澧烇紝涓斿彲澧炲姞寮曠墿涔嬮枔褰㈡垚浜岃仛楂旂殑姗熸渻銆�
瀵﹂娉ㄦ剰浜嬮爡锛�
1锛塕T-PCR鍙互妾㈡脯绲勭箶銆佺窗鑳�銆佽娑�銆佺窗鑿岀瓑寰堝鏉愭枡锛屼笉鍚岀殑妯ｆ湰鏈変笉鍚岃姹�锛屽椹楀墠璜嬪厖鍒嗘簼閫氱⒑瑾嶅椹楁柟妗堝拰妯ｆ湰鎯呮硜锛�
2锛夊鎴剁洝鍙兘鎻愪緵瀵﹂鐨勮儗鏅俊鎭�佺墿绋�銆佸熀鍥犳簴纰虹殑鍚嶇ū鍜孖D铏�锛�
3锛夊鎴剁洝閲忎笉瑕佹彁渚汥NA鎴朢NA妯ｅ搧銆�
4锛夋ǎ鏈繚瀛樹簬娑叉爱鎴栧共鍐帮紝涔熷彲浠ヤ繚瀛樹簬Trizol娑蹭腑銆�
瀵︽檪鐔掑厜瀹氶噺PCR锛坬uantitative real-time PCR锛宷PCR锛夋槸鎸囧湪PCR鍙嶆噳楂旂郴涓姞鍏ョ啋鍏夊熀鍦�锛屽埄鐢ㄧ啋鍏変俊铏熺⿳绱鏅傜洠娓暣鍊婸CR閫茬▼锛�*閫氶亷妯欐簴鏇茬窔灏嶆湭鐭ユā鏉块�茶瀹氶噺鍒嗘瀽鐨勬柟娉�銆傚鏅傜啋鍏夊畾閲廝CR鐨勫寲瀛稿師鐞嗗寘鎷帰閲濋鍜岄潪鎺㈤嚌椤炲叐椤�锛屾帰閲濋鏄埄鐢ㄨ垏闈剁窗鑳炲簭鍒楃壒鐣版�ч洔浜ょ殑鎺㈤嚌渚嗘寚绀烘摯澧炵敘鐗╃殑澧炲姞锛岄潪鎺㈤嚌椤炴槸鍒╃敤鐔掑厜鏌撴枡鎴栬�呯壒鐣版�цō瑷堢殑寮曠墿渚嗘寚绀烘摯澧炵殑澧炲姞銆傞亱鐢ㄨ┎鎶�琛撳彲浠ュ皪DNA銆丷NA妯ｅ搧閫茶瀹氶噺锛堝寘鎷�*瀹氶噺鍜岀浉灏嶅畾閲忥級鍜屽畾鎬у垎鏋�銆�
涓昏鏈嶅嫏锛欴NA鎴朢NA鐨�*瀹氶噺鍒嗘瀽銆佸熀鍥犺〃閬斿樊鐣板垎鏋�銆佸熀鍥犲垎鍨�銆�
涓昏鎶�琛擄細寮曠墿瑷▓銆丷NA鎻愬彇銆乧DNA鍚堟垚銆乹PCR銆�
- 01
- 02
- 03
- 04
- 05
- 06
UNIVER闆荤闁ョ铏熻┏瑙ｏ細宸ヤ綔鍘熺悊鑸囨噳鐢ㄤ竴绐虹┒绔�
- 07
- 08
ASCO闆荤闁ョ殑宸ヤ綔鍘熺悊銆佸瀷铏熷弮鏁稿強鍏ч儴绲愭瑭宠В
- 09
- 10
- 11
- 鍑℃湰缍叉敞鏄�"渚嗘簮锛氭櫤鑳藉埗閫犵恫"鐨勬墍鏈変綔鍝�锛岀増娆婂潎灞簬鏅鸿兘鍒堕�犵恫锛岃綁杓夎珛蹇呴爤娉ㄦ槑鏅鸿兘鍒堕�犵恫锛宧ttp://www.lfljgfsj.com銆傞仌鍙嶈�呮湰缍插皣杩界┒鐩搁棞娉曞緥璨换銆�
- 浼佹キ鐧煎竷鐨勫叕鍙告柊鑱炪�佹妧琛撴枃绔�銆佽硣鏂欎笅杓夌瓑鍏у锛屽娑夊強渚垫瑠銆侀仌瑕忛伃鎶曡ù鐨�锛屼竴寰嬬敱鐧煎竷浼佹キ鑷鎵挎摂璨换锛屾湰缍叉湁娆婂埅闄ゅ収瀹瑰苟杩芥函璨换銆�
- 鏈恫杞夎級骞舵敞鏄庤嚜鍏跺畠渚嗘簮鐨勪綔鍝�锛岀洰鐨勫湪浜庡偝閬炴洿澶氫俊鎭紝骞朵笉浠ｈ〃鏈恫璐婂悓鍏惰榛炴垨璀夊鍏跺収瀹圭殑鐪熷鎬�锛屼笉鎵挎摂姝ら浣滃搧渚垫瑠琛岀偤鐨勭洿鎺ヨ铂浠诲強閫ｅ付璨换銆傚叾浠栧獟楂斻�佺恫绔欐垨鍊嬩汉寰炴湰缍茶綁杓夋檪锛屽繀闋堜繚鐣欐湰缍叉敞鏄庣殑浣滃搧渚嗘簮锛屽苟鑷矤鐗堟瑠绛夋硶寰嬭铂浠�銆�
- 濡傛秹鍙婁綔鍝佸収瀹广�佺増娆婄瓑鍟忛锛岃珛鍦ㄤ綔鍝佺櫦琛ㄤ箣鏃ヨ捣涓�鍛ㄥ収鑸囨湰缍茶伅绯�锛屽惁鍓囪鐐烘斁妫勭浉闂滄瑠鍒┿��
